IP-WB活性检测试剂盒的行业须知

1. vasp通过调节rab11依赖性tgf-β受体的质膜靶向来促进肝星状细胞的tgf-β活化

    肝l病学第61卷，首1期，第361-374页，2015年1月

2. rab5活性调节glut4分类为-反应性和非-反应性内体室：-抵抗发展的潜在机制。

    内分l泌学。 2014年9月; 1559：3315-28

将裂解液转移到适当大小的试管中，并置于冰上。

如果发生核裂解，则细胞裂解液可能变得非常粘稠，难以移液。 如果发生这种情况，可将裂解液通过27?号注射l器针头3-4次以剪切基因组dna。

通过离心10分钟在4°c下为12,000 x g清除裂解物。

收集上清液并将样品保存在冰上以备立即使用，或速冻并保存在-70°c以便将来使用。

阳性对照和阴性对照的体外gtpγs/ gdp蛋白质上样量

注意：体内细胞-将激l活可用arf 6的大约10％，而体外gtpγs蛋白负载将激l活arf 6的将近90％。

1，将0.5 ml每种细胞提取物等分到两个微量离心管中或使用1 μg纯化的arf 6蛋白。

2，向每个试管中加入20 μl 0.5 m edta终浓度为20 mm。

3，将5 μl 100 xgtpγs至100 μm，终浓度加到一个试管中阳性对照。

4，在第二个试管中加入5 μl 100 x gdp至1 mm，终浓度阴性对照。

5，在搅拌下将试管在30°c孵育30分钟。

6，通过将试管放在冰上并添加32.5 μl 1 m mgcl2至60 mm，终浓度来停止加载。

arf6激l活测定。 经gdplane1或gtpγslane 2处理后，纯化的arf6蛋白被免l疫沉淀。 用抗活性arf6单克l隆抗l体进行免l疫沉淀。

电泳和转膜

1. 取15ul样品/孔上样17%配体胶。

2. 按照制造商的说明进行sds-page。

3. 按照制造商的说明将凝胶蛋白转到pvdf或硝化纤l维素膜。

免l疫印迹反应和检测所有步骤都是在室温下进行，并不断搅拌

1. 将pvdf膜浸入100%甲l醇15s，然后在室温放置5 min晾干。

注意：如果使用的是硝化纤l维素膜，此步省略。

2. 封闭：用tbst缓冲液配制5%的脱脂牛奶或者3%bsa在室温下孵育1h进行封闭，并需要恒定振荡。

3. 孵育一抗：用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa稀释特-识别cdc42活性构象的兔多克l隆抗l体稀释比例为1:50-1:1000，主要根据样品中含有的cdc42蛋白的量，室温下孵育1-2小时，或者4°c条件下过夜孵育。

4. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

5. 孵育二抗：例如羊抗兔igg-hrp，用tbst缓冲液配制的5%脱脂牛奶或3%bsa按1:1000稀释比例稀释后使用，室温下孵育1小时并恒定振荡。

6. 用tbst缓冲液洗涤膜三次/5min。

7. 使用实验者所选择的检测方法进行显色如ecl显色法。